Laporan Kultur Jaringan Matakuliah Bioteknologi Smt 3

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI

                                                  “KULTUR JARINGAN”      

Disusun Oleh:

Nama            : TESA DWI PRIHANDINI

NIM             : 135040207114001

Kelompok: 1 (satu)

Asisten         : Kak Fahma

Program Studi Agroekoteknologi

Fakultas Pertanian

Malang

2014

BAB I

PENDAHULUAN

1.1.Latar Belakang

Cara membudidayakan tanaman secara vegetative salah satunya adalah kultur jaringan, yaitu  dengan menggunakan teknik mengisolasi bagian tanaman tertentu seperti daun, mata tunas, embrio serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam medium yang dibuat steril dengan kandungan nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang transparan atau tembus cahaya sehingga tanaman dapat melakukan proses fotosintesis sehingga dapat memperbanyak diri dan bergenerasi secara lengkap dan menjadi tanaman baru yang mempunyai sifat seperti induknya.

Manfaat yang dapat diperoleh dari cara membudidayakan tanaman dengan cara kultur jaringan tumbuhan yaitu diantaranya mendapatkan tanaman yang banyak dengan waktu yang relative singkat, mempunyai sifat yang sama dengan induknya, tanaman yang bebas virus, memperoleh bibit unggul dan sebagai penyimpan plasma nutfah.

Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media kultur yang baik seharusnya menyediakan unsur hara baik makro maupun mikro, sumber vitamin dan asam amino, sumber karbohidrat, zat pengatur tumbuh, senyawa organik sebagai tambahan seperti air kelapa, ekstrak buah dll, bahan pemadat agar-agar dan gelrite dan juga menyediakan arang aktif untuk kasus tertentu untuk tanaman.

1.2.Tujuan

-        Untuk mengetahui teknik dan cara melakukan kultur jaringan

-        Untuk mengetahui tahapan – tahapan dalam kultur jaringan

-        Untuk Mengetahui dan dapat melakukan perbanyakan tanaman khususnya pada tanaman krisan teknik kultur jaringan

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Kultur Jaringan dan Macam Teknik Kultur

Kultur jaringan tediri atas dua macam teknik kultur, yaitu kultur organ dewasa dan kultur bakal organ. Kultur organ dewasa pada umumnyadipakai untuk mempertahankan kehidupan organ yag diambil dari tubuh baik yang masih sehat maupun kehidupan organ yang tidak mungkin dapat bertahan hidup. Kultur bakal organ memelihara jaringan-jaringan bakal organ untuk dikembangkan di dalam kondisi in-vitro (Smith, 2000). 

·         Isolasi Eksplan adalah Pemisahan atau pengucilan sel yang akan dieksplan terhadap bahan yang akan ditanam pada media kultur.

·         Isolasi Eksplan adalah Perlindungan atau penyekatan yang dilakukan pada bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan tanam pada sebuah media tanam (plantlet).                                            

                                                                          (Zulkifli, 2008)

·         Inkubasi Eksplan adalah Masa atau tenggang waktu antara masuknya kontaminan terhadap bahan tanam (Media tanam )yang akan di tanam.

·         Inkubasi Ekpslan adalah waktu yang digunakan atau yang diperlukan oleh  penyebab penyakit atau kontaminan untuk masuk ke eksplan tanaman.

(Williams, 2003)

      

2.2. Ekplan dan Syarat Eksplan yang Baik

Sebelum melakukan kultur jaringan untuk suatu tanaman, kegiatan yang pertama harus dilakukan adalah memilih bahan induk yang akan diperbanyak. Untuk tanaman yang akan di kultur jaringkan.  Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman indukkan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca ( greenhouse ) agar eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas dari sumberkontaminan pada waktu dikulturkan secara in-vitro.

Pemeliharaan rutin yang harus dilakukan meliputi: pemangkasan, pemupukan, dan penyemprotan dengan pestisida (fungisida, bakterisida, dan insektisida), sehingga tunas baru yang tumbuh menjadi lebih sehat dan dan bersih dari adanya kontaminan. Selain itu, pengubahan status fisiologi tanaman induk sumber eksplan kadang-kadang perlu dilakukan seperti memanipulasi parameter cahaya, suhu, dan zat pengatur tumbuh. Manipulasi tersebut bisa dilakukan dengan mengkondisikan tanaman induk dengan fotoperiodisitas dan temperatur tertentu untuk mengatasi dormansi serta penambahan ZPT seperti sitokinin untuk merangsang tumbuhnya mata tunas baru dan untuk meningkatkan reaktivitas eksplan pada tahap inisiasi kultur (Yusnita, 2005).

            Ukuran eksplan juga mempengaruhi keberhasilan kultur. Eksplan dengan ukuran kecil lebih mudah disterilisasi dan tidak membutuhkan ruang serta media yang banyak, namun kemampuannya untuk beregenerasi juga lebih kecil sehingga dibutuhkan media yang lebih kompleks untuk pertumbuhan regenerasinya. Sebaliknya semakin besar eksplan maka semakin besar kemungkinannya untuk membawa penyakit dan makin sulit untuk disterilkan, membutuhkan ruang dan media kultur yang lebih banyak. Ukuran eksplan yang sesuai sangat tergantug dari jenis tanaman yang dikulturkan, teknik dan tujuan pengkulturannya (Wattimena, 1992).

2.3. Macam-macam Sterilisasi Alat Bahan dan Eksplan

a)    Sterilisasi Bahan

Bahan yang akan digunakan sebagai media kultur jaringan harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf pada suhu 121˚C selama 45 menit.

b)   Sterilisasi Alat

Pensterilan LAFC dengan menggunakan sinar UV selama 20 menit juga menyemprotkan alkohol 70% pada semua alat yang akan digunakan, termasuk tangan yang akan melakukan kultur jaringan.

c)    Sterilisasi Eksplan

Langkah pertama yaitu eksplan dicuci dengan deterjen atau bahan pencuci lain, selanjutnya direndam dalam bahan-bahan sterilan baik yang bersifat sistemik maupun desinfektan. Bahan yang digunakan serta metode sterilisasi biasanya berbeda untuk setiap bahan tanaman. Dengan demikian setiap pekerjaan kultur jaringan, cara sterilisasi eksplan harus dicoba beberapa kali .

(Suryowinoto, 1996)

2.4. Kontaminasi pada Kultur Jaringan

Kontaminasi merupakan permasalahan mendasar yang sering terjadi pada kultur in vitro. Pada kondisi media yang mengandung sukrosa dan hara, serta kelembaban dan suhu yang relatif tinggi, memungkinkan mikroorganisme serta spora jamur tumbuh dan berkembang dengan pesat. Kontaminasi pada kultur in vitro dapat berasal dari:

·      Udara

·      Eksplan, baik secara eksternal maupun internal.

·      Organisme kecil yang masuk ke dalam media, seperti semut.

·      Botol kultur serta alat-alat yang kurang steril.

·      Lingkungan kerja dan ruang kultur yang kotor.

·      Kecerobohan dalam bekerja.

Setiap eksplan memiliki tingkat kontaminasi permukaan yang berbedan tergantung dari :

·      Jenis tumbuhannya

·      Bagian tumbuhan yang dipergunakan

·      Morfologi permukaan (misalnya berbulu atau tidak)

·      Lingkungan tumbuhnya (Green house atau lapang)

·      Musim waktu pengambilan (musim penghujan atau musim kemarau)

·      Umur tumbuhan (seedling atau tumbuhan dewasa)

·      Kondisi tumbuhannya (sehat atau sakit)

Mikroorganisme penyebab kontaminasi dapat berupa bakteri, fungi, protozoa, serangga, virus dan lain-lain. Kontaminasi oleh fungi ditandai dengan munculnya benang-benang halus yang berwarna putih, yang merupakan miselium fungi. fungi dapat menginfeksi jaringan secara sistemik sehingga lama kelamaan dapat menyebabkan jaringan eksplan akan mati. Selain itu, kontaminasi oleh bakteri ditandai munculnya bercak-bercak berlendir pada media atau eksplan. Bercak tersebut biasanya berwarna putih yang merupakan koloni bakteri. Bakteri lebih sulit untuk dideteksi dibandingkan dengan fungi karena dapat masuk ke dalam ruang antar sel.

Ada dua istilah dalam permasalahan kontaminasi, yaitu kontaminasi eksternal dan kontaminasi internal.

a.    Kontaminasi eksternal atau kontaminasi permukaan biasanya disebabkan oleh mikroorganisme yang berasal dari luar eksplan. Respon kontaminasi eksternal ini sangat cepat karena mikroorganismenya berada permukaan eksplan. Kontaminasi permukaan dapat diatasi dengan cara :

·    Karantina tanaman induk dalam greenhouse

·    Sterilisasi kontak dengan menyikat eksplan dengan sikat halus

·    Pencucian menggunakan berbagai perlakuan bahan kimia dan durasii sterilisasi.

·     Jika permukaan tanaman ditutupi oleh rambut atau sisik, menggunakan detergen dan digoyang –goyang untuk mengilangkan gelembung udara yang mungkin mengandung mikroorganisme.

·          Penggunaan kombinasi bahan sterilan.

b.    Kontaminasi Internal

Kontaminasi yang disebabkan oleh mikroorganisme yang berasal dari eksplan yang tumbuh dan berkembang secara bertahap dalam kondisi in vitro. Pertumbuhan dan perkambangan mikroorganisme internal biasanya muncul beberapa minggu / bulan setelah di kultur. Kontaminasi internal dapat diminimalisir atau dapat diatasi dengan cara:

·      Karantina tanaman induk dalam greenhouse

·       Menggunakan HgCl2 , antibiotik dan fungisida sistemik

·      Contoh antibiotik alami yaitu propolis

·      Contoh antibiotika sintetik yaitu Plant Preservative Mixture (PPM),  Cefotaxime, Ceftriaxone, Chlorampenicol, Rifampicin, dll.

·      Penggunaan kombinasi bahan sterilan.

(Luri, 2014)

BAB III

METODOLOGI

3.1. Alat dan Bahan

       Alat

-        Pinset untuk memindahkan bahan/ sebagai pengganti tangan saat penelitian

-        Pisau scalpel untuk memotong bahan

-        Cawan petri untuk tempat bahan

-        Botol kultur yang telah berisi media MS dan sudah di sterilkan

-        Botol spiritus untuk strelilisasi alat

       Bahan

-        Tunas pucuk tanaman krisan sebagai bagian yang akan dikulturkan

-        Media MS sebagai media tumbuh eksplan

-        Alkohol 90%

-        Alkohol 70%

-        Cloroks (Bayclin) untuk mensterilkan eksplan

-        Detergen untuk sterilisasi awal, membersihkan kotoran yang menempel pada eksplan

-        Benlate

-        Aquades steril untuk membilas eksplan dari cloroks dan detergen

3.2. Metode Kultur Jaringan

Sterilisasi Eksplan

Potong nodus batang krisan sesuai kebutuhan (lebihkan ukuran pemotongannya)

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi detergen dan kocok selama 10 menit, bilas pada air mengalir

 

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi cloroks (bahan aktif NaOCl) 30%, kocok selama 10 menit, bilas dengan aquades

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi Fungisida (Benlate), rendam selama 5 menit, bilas dengan aquades

Masukkan ke dalam botol yang telah berisi aquades steril dan masukkan ke dalam LAFC

 Penanaman/ Kultur Organ

Siapkan alat dan bahan serta planlet yang telah disterilisasi

                                                           

Sebelum digunakan, bersihkan LAFC kemudian sterilkan dengan sinar UV selama 20 menit.

      

Sebelum melakukan penanaman, semprotkan alcohol 70% pada tangan dan semua botol yang akan digunakan

Alat-alat yang akan digunakan diatur dengan rapi pada LAFC, posisi scalpel dan pinset serta alcohol 90% yang digunakan untuk mensterilkan dissecting kit disebelah kiri Bunsen sedangkan botol kultur disebelah kanan

                                                  
          

Masukkan planlet kedalam LAFC

 

Ambil planlet dan keringkan dengan tissue steril

Planlet dipotong dengan pisau scalpel diatas petridish

Sebelum dan sesduah menggunakan pinset maupun scalpel celupkan ke dalam ethanol 90%, lalu dibakar pada nyala api bunsen.

Tanam eksplan pada media tanam yang bibir botolnya sudah disterilkan dengan cara dibakar pada nyala api bunsen

Botol kultur ditutup plastic wrafing lalu diikat dengan karet gelang

Simpan botol kultur yang telah ditanami eksplan pada ruang kultur

Amati perkembangannya selama 14 hari

BAB IV

PEMBAHASAN

4.1. Hasil Pengamatan

4.2. Pembahasan Kondisi Pertumbuhan Eksplan

            Menurut hasil praktikum kultur jaringan, tanaman yang digunakan sebagai eksplan adalah tanaman bunga krisan. Yaitu mengkulturkan ketiak batang yang memiliki mata tunas. Kemudian setelah dilakukan serangkaian kegiatan pensterilan alat bahan tanam dan setelah dilakukan penanaman pada media MS dilakukan pengamatan selama kurang lebih 2 minggu pada eksplan. Hasil yang telah didapatkan, di sajikan dalam bentuk tabel seperti diatas.

            Kemudian pada minggu pertama dan kedua keadaan eksplan terlihat masih baik tidak ada kontaminasi dari jamur juga tidak terjadi browning pada eksplan, tetapi belum terjadi pertumbuhan yang ditunjukkan oleh eksplan. Dan pada minggu ketiga eskplan terindikasikan telah terkontaminasi oleh bakteri yang terlihat pencoklatan pada media.

                        Untuk perakaran digunakan media MS + NAA. Proses perakaran pada umumnya berlangsung selama 1 bulan. Planlet (tunas yang telah berakar) diaklimatisasikan sampai bibit cukup kuat untuk ditanam di lapang. Aklimatisasi. Dapat dilakukan di rumah kaca, rumah kasa atau pesemaian, yang kondisinya (terutama kelembaban) dapat dikendalikan. Planlet dapat ditanam dalam dua cara. Pertama, planlet ditanam dalam polibag diameter 10 cm yang berisi media (tanah + pupuk kandang) yang telah disterilkan. Planlet (dalam polibag) dipelihara di rumah kaca atau rumah kasa. Kedua, bibit ditaruh di atas bedengan yang dinaungi dengan plastik. Lebar pesemaian 1-1,2 m, panjangnya tergantung keadaan tempat. Dua sampai tiga minggu sebelum tanam, bedengan dipupuk dengan pupuk kandang (4 kg/m2) dan disterilkan dengan formalin 4%. Planlet ditanam dengan jarak 20 cm x 20 cm. Aklimatisasi berlangsung selama 2-3 bulan. Aklimatisasi cara pertama dapat dilakukan bila lokasi pertanaman letaknya jauh dari pesemaian dan cara kedua dilakukan bila pesemaian berada di sekitar areal pertanaman (Pardal, 2012)

4.3. Pembahasan Faktor Keberhasilan dan Kegagalan Kultur

            Berdasarkan pada penelitian praktikum kultur jaringan yang saya lakukan, eksplan tidak mengalami kontaminasi di pengamatan minggu pertama dan kedua, namun eksplan mengalami kontaminasi pada minggu ketiga.. Pertumbuhan eksplan yang ditanam belum mengalami perubahan yang signifikan namun berada dalam keadaan yang baik hingga akhirnya eksplanpun harus sakit dikarenakan telah terkontaminasi oleh bakteri dan tidak bisa tumbuh dengan maksimal. Hal ini bisa jadi disebabkan karena kurang sterilnya kondisi saya maupun lingkungan, meskipun pada saat persiapan penanaman eksplan, batang yang akan ditanam sudah di sterilkan terlebih dahulu menggunakan detergen, cloroks dan juga fungisida.

            Selain itu pada saat penanaman eksplan pada media MS juga dilakukan dengan cara yang sangat steril seperti penyinaran LAFC dengan ultra violet selama 20 menit sebelum pakai, penyemprotan alkohol 70% pada tangan sebelum melakukan penanaman juga pembakaran alat dengan bunsen, sehingga eksplan diharapkan tidak mengalami kontaminasi. Lamanya waktu yang kita habiskan saat menanam juga dapat mempengaruhi, jadi semakin lama proses kita menanam eksplan semakin besar pula peluang eksplan untuk terkontaminasi jamur maupun bakteri.

            Pencoklatan atau browning pada eksplan dapat terjadi akibat kurangnya perendaman eksplan oleh larutan pemutih atau pembersih yang dapat mengurangi terjadinya browning atau dapat juga disebabkan oleh terlalu lamanya kontak eksplan dengan udara luar sebelum eksplan ditanam (Zakaria, 2007).

Menurut Susilowati (2001) sumber kontaminasi dapat berasal dari eksplan tumbuhan, organisme kecil yang masuk ke dalam media, alat yang tidak steril dan lingkungan kerja yang kotor. Sehingga harus dilakukan sterilisasi lingkungan kerja, alat-alat, media dan bahan tanaman.

Perbandingan dengan jurnal yang didapat : Hasil dari penelitian ini juga dengan jelas menunjukkan bahwa komposisi media (kombinasi auksin dan sitokinin) sangat mempengaruhi pertumbuhan dan multiplikasi tanaman krisan. Adanya perbedaan tingkat multiplikasi dan kebutuhan terhadap komposisi media (kombinasi dan konsentrasi zat pengatur tumbuh) diduga disebabkan oleh perbedaan dari genotipe (varietas) tanaman yang digunakan. Perbedaan kandungan fitohormon dari setiap varietas krisan yang digunakan mungkin  telah menyebabkan perbedaan respons dalam kultur jaringan.

BAB V

PENUTUP

5.1. Kesimpulan

            Kesimpulan yang dapat diambil pada praktikum kali ini adalah bahwa pada eksplan yang ditanam pada media MS mengalami kontaminasi dari bakteri. Pada hari pertama pengamatan hingga hari kedua pengamatan eksplan menunjukkan keadaan yang baik, namun saat di hari pengamatan ketiga telah terkontaminasi.

            Terkontaminasinya eksplan dapat disebabkan karena pada saat praktikum semua alat dan bahan berada dalam keadan kurang steril yang menyebabkan masih dimungkinkan bahwa eksplan dapat terkontaminasi. Lama pengerjaan pada saat penanaman juga mempengaruhi kondisi eksplan saat pertumbuhan.

5.2. Kritik dan Saran

            Praktikum berjalan dengan sangat tertib. Kakak Asisten praktikum juga sangat menguasai materi sehingga semua berjalan dengan lancar. Terima kasih kak atas materi yang bermanfaat tesebut.

DAFTAR PUSTAKA

Gunawan, 1995 dalam Wulandari S., Wan Syafii dan Yossilia, 2004. Respon Eksplan Daun Tanaman Jeruk Manis (Citrus sinensis L.) Secara In Vitro Akibat Pemberian NAA Dan BA, Jurnal Biogenesis.

Luri, Sepdian. 2014. Permasalahan-permasalaha Kultur In-Vitro. http://kulturjaringan.blogspot.com/2014/03/permasalahan-permasalahan-dalam-kultur.html (Diakses pada 15 Desember 2014)

Pardal, Saptowo J. 2012. Regenerasi Tanaman secara In-Vitro

http://biogen.litbang.pertanian.go.id/index.php/2012/09/regenerasi-tanaman-secara-in-vitro-dan-faktor-faktor-yang-mempenaruhi/ (Diakses pada 15 Desember 2014)

Smith, R.H. 2000. Plant Tissue Culture : teqhnique and experiments. Academic Press : London.

Williams.2003. Teknik Multiplikasi Pada Kultur Organ. Bioteknologi Modern. Biologi : Tissue Culture of Multiplication For organisms. New York : USA.

Yusnita.2005.Kultur Organ Tanaman Eksplan. Balai Pengakajian Ilmiah. Universitas Sudirman : Yogyakarta.

Zakaria, F. 2007. Perbanyakan Bibit Jati (Tectona grandis) Kultur Jaringan di Pusat Pengembangan Sumber Daya Hutan. PKL tidak diterbitkan. Malang :Program Strata 1 UMM

Zulkifli.2008.http://9fly.wordpress.com/2008/12/22/kultur-jaringan-tumbuhan/.Diakses tanggal 15 Desember 

Jurnal yang saya gunakan adalah :

MULTIPLIKASI EMPAT VARIETAS KRISAN MELALUI TEKNIK KULTUR JARINGAN

Multiplication Of Four Chrysant Varieties Via Tissue Culture Technique

Zainuddin Basri1)

1) Jurusan Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian, Universitas Tadulako,  Jl. Soekarno-Hatta Km 5 Palu 94118, Sulawesi Tengah Telp./Fax : 0451-429738